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快速培养在结核病细菌学诊断中的应用

王苏民 付育红 李云絮 赵丽平 毕志强 卫生部结核病控制中心

   近年来全球结核病疫情的回升已经引起了人们的强烈注意。而人口的增加、AIDS合并结核病、耐药结核病和移民是引起结核病疫情回升的四个重要原因。严重地危害了广大人民的健康水平。结核病当今全球范围最具有临床意义的感染性疾病之一,是单因所致的感染性疾病中死亡率最高的疾病,是一个严重的公共卫生问题。WHO1993年宣布"全球结核病紧急状态",号召全世界动员起来"主动制止结核病"。

一、我国结核病疫情的严重性
   我国属于全球结核病高负担国家之一。结核病的患病人数在世界各国中居于第二位。结核病是危害人民健康的重要传染病之一。我国的结核病疫情呈三高一低,即患病率高、死亡率高、耐药率高、年递降率低。估计全国有肺结核病患者600余万人,75%的病人年龄在15-54岁之间结核病成为当前农村中因病致贫,因病返贫的主要传染病。

二、结核病细菌学检查现状
   结核病人的细菌学检查,是发现传染源的主要途径和手段,是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据,也是考核疗效,评价治疗效果的可靠标准,是国家结核病控制规划(NTP)的重要组成部分。在结核病防治工作中起着不可缺少的重要作用。但常用的细菌学检查方法尚存在着灵敏度低,操作复杂,须时间较长和影响因素较多等问题。因此,发展特异,敏感,早期,快速,简便和预测预后的结核病细菌学检查方法是大家共同期盼的。

三、常用的细菌学检查方法
1、痰涂片镜检法:特点:快速,当天出结果,但不分死菌活菌,敏感性低,需5000-10000条菌/ml,特异性差,各种抗酸杆菌均可着色。
2、痰结核菌常规培养法;特点:时间长,2-8周,但可分死菌活菌,敏感性低,涂片阳性标本只有约80%培养阳性特异性差,各种分支杆菌均可生长,须结合药物敏感性实验和分支杆菌菌种鉴定须时更长。
3、药物敏感性实验:用于鉴定结核分支杆菌对抗结核药物的敏感性水平。
4、分支杆菌菌种鉴定:用于鉴定分支杆菌菌种。

四、痰结核菌常快速养系统:
   由于分枝杆菌的遗传特性决定的生长周期长、致使常规细菌学检查方法检出率低、不易标准化等原因,使细菌学诊断发展缓慢,无法充分满足临床诊断的需要。20世纪70年代发展了的一种新的结核病细菌学检查方法---痰结核菌常快速养,这一方法具有操作简单,自动化强,灵敏,快速等优点。促进了结核病细菌学诊断学的发展。最早使用的仪器是美国BD公司研制生产的全自动分枝杆菌检测系统BACTEC?460TB。这一系统多年来在结核病的细菌学诊断中起到了重要作用,但是由于采用了放射性同位素, 存在放射性污染问题。BD公司于1998年又研制推出了大容量、安全、快速、全自动分枝杆菌培养、检测、药敏系统-BACTEC? MGIT? 960系统。采用连续荧光探测法,避免了放射性元素对环境的污染。

1、工作原理:
1)BACTEC?460TB系统检测原理:是测定分枝杆菌的代谢产物,在Middlebrook? 7H12培养瓶中加入含有放射性14C棕榈酸底物,当检测标本经处理接种于含杂菌抑制剂NAP的培养瓶内,如有分枝杆菌存在,分枝杆菌代谢时将酶解培养瓶中标记14C棕榈酸基底物,使其脱羧产生带有放射性的14CO2,BACTEC?460TB将培养瓶中14CO2送入电离室,并自动显示测定结果,以生长指数GI(GROWTH INDEX)表示,如生长指数升高达到一定程度报告阳性结果。

2)BACTEC? MGIT? 960系统工作原理:使用BBL? MGIT?分枝杆菌快速培养管。在MGIT? Middlebrook?7H9培养基底部硅酮树脂内埋置对氧分子浓度极为敏感的荧光指示剂,若培养管内接种的标本中有分枝杆菌生长,培养管内的氧气将被消耗,管底的荧光指示剂将在内置紫外激发光的照射下发出荧光,荧光强度变化直接反映培养管内分枝杆菌生长状态。BACTEC MGIT 960荧光强度记忆探测器将每隔60分钟连续自动测定培养管内荧光强度的变化,经过计算机处理系统分析从而判断管内分枝杆菌的生长情况。

2、BACTEC? MGIT? 960系统操作步骤:
1)将待检样本用等量N-乙酰-半胱氨酸-4%NAOH混合液去污染消化处理,离心待用。
2)在MGIT管标签上直接标记
3)旋开MGIT管盖,在无菌条件下用滴管加入0.8mlOADC与PANTA混合液
4)加入0.5ml处理好的标本(注意:标本量超过0.5ml会增加污染机会)
5)旋紧管盖,适当混匀
6)拉开BACTEC MGIT 960的抽屉,按下放入标本键,此时条形码扫描器会自动开启,将标本管靠近条形码扫描器,轻轻转动,将标本管放入闪绿色LED灯的位置,关上抽屉,仪器自动检测。

3、卫生部结核病控制中心于2000年购进了BACTEC? MGIT? 960系统并与原有的BACTEC?460TB系统进行了初步的比较。结果如下:
1)为了对BACTEC?460TB与BACTEC? MGIT? 960及改良罗氏培养系统进行比较,我们收集了105份临床标本,其中结核病例82份,其他肺部疾病23例。在82份结核病病例中,960阳性25份,460阳性17份。其它肺部疾病23例均为阴性。结果见表1:
           表1:BACTEC? MGIT? 960与BACTEC?460TB
           样本数   总阳性率   涂阳培阳(%)   涂阳培阴(%)  涂阴培阳(%)
    BACTEC960   82    30.5%    19 (86.4)     3 (13.6)    6 (10.0)
    BACTEC460   82    20.7%    13 (59.1)     7 (31.8)    4 (6.7)
   从上表中可以看出,BACTEC? MGIT?960的培养阳性率(30.5%)高于BACTEC?460TB(20.7%),阳性率有所增加。

2)我们对BACTEC? MGIT? 960与BACTEC?460TB的阳性报告时间进行了比较,结果见表2。
         表2:BACTEC? MGIT? 960与BACTEC?460TB的阳性报告时间的比较
   阳性报告时间(天) 3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16
   BACTEC 960系统   16   4     5
   BACTEC 460系统   1  1    3  2  2  4     1  2          1
   从表2的结果可以看出BACTEC? MGIT? 960系统较BACTEC?460TB系统的阳性报告时间有明显的减少。BACTEC? MGIT? 960系统报出阳性结果的比例3天为64%,5天为80%,7天为100%;BACTEC?460TB系统报出阳性结果的比例3天为4%,7天为28%,11天为88%。

3)我们也集中收集了26份临床结核病例,同时用BACTEC960,BACTEC 460与罗氏培养作比较,BACTEC960阳性12例,BACTEC 460阳性5例,罗氏培养阳性12例,比较表3:
            表3:BACTEC? MGIT? 960与罗氏培养的比较
        样本数 总阳性率  涂阳培阳(%)  涂阳培阴(%) 涂阴培阳(%)
   BACTEC960  26  30.8%    8(100.0)    1 (12.5)    3(16.6)
   BACTEC460  26  19.2%    5(100.0)
   罗氏培养   26  30.8%    8(100.0)    1 (12.5)    3(16.6)
   从表3可以看出,BACTEC960,BACTEC460与罗氏培养的结果大致相似。但由于研究的例数太少,尚无法得出更多的结论。

五、结论:
  结核病细菌学快速检测方法已经有了20多年的历史,在世界上多个国家得到广泛的应用,取得了良好的效果。仪器检测标本的种类广泛可包括:痰、胸腹水、体液、脑脊液、组织块等非血液标本。与常规培养相比,自动化强,减少了烦琐的人工劳动;阳性报告时间较常规培养明显缩短;且可以动态检测。在结核病控制工作中发挥了重要作用。特别是BACTEC MGIT 960问世以后克服了BACTEC 460 TB的不足之处使这一技术进一步完善。BACTEC MGIT 960与BACTEC 460 TB具有以下的优点:
1. 无放射性污染,由此可省去相关的步骤和废弃物的处理,节省了实验室空间,保护了工作人员免受放射性元素污染。
2. 系统提供由微电脑控制的培养箱,提供分枝杆菌生长需要的最佳环境。
3. 系统内置计算机,采用图形界面,简单易懂,可自动存储数据,支持多机相连。
4. 内置条形码扫描器、软盘驱动器、各种指示灯,工作人员的各步操作一目了然,方便快捷。
5. 采用抽屉式培养箱放置标本,每个抽屉内有320个瓶位,一共有960个瓶位,每年可处理8000份标本,适用于各级实验室的检测需求。
6. 系统24小时连续检测,每小时自动测定一次培养管的荧光强度变化,利于快速早期发现分枝杆菌生长情况,使阳性标本检出时间缩短至3-6天。并且系统内置实验标准管,每小时自动进行一次质控,自动化程度高。

  为了适合样本量小的用户的需求,BD公司还推出了BBL? MGIT?手工荧光判读器,工作原理、实验步骤、使用的耗材与BACTEC? MGIT? 960相同的,它可以直接判断培养结果,内含定标管,操作简单快捷。由于其设计精巧,便于携带,使其更适合异地考察,进行流行病学调查等工作的需要。



 
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